In English

Engineering of 3 methylaspartate ammonia-lyases for biobased adipic acid production

Robin Van Havere
Göteborg : Chalmers tekniska högskola, 2017. 109 s.
[Examensarbete på avancerad nivå]

The current traditional adipic acid production is a highly polluting process. Researchers have been  studying bio‐based pathways to produce adipic acid in an environmentally sustainable way. One of  these bioprocesses could involve the use of a metabolic pathway to produce adipic acid from lysine.  The pathway first enzymatic reaction is the deamination of lysine into 6‐aminohex‐2‐enoic acid. No  enzyme has been discovered yet to catalyse this reaction.   The study of an enzyme able to do this conversion was the main aim of this thesis. Several ammonia  lyases were considered as interesting enzymes to study since these enzymes are able to do a  deamination on aminoacids, though different than than lysine. The enzyme studied in this research  project is 3‐methylaspartate ammonia lyase (MAL) which catalyses the deamination reaction on 3methylaspartic acid. The 3‐methylaspartic acid has a comparable structure to lysine and makes the  MAL enzyme an appropriate candidate to study the conversion. However, the MAL enzyme did not  show any activity towards lysine. Preliminary results obtained from computational structural biology  experiments of MAL in the presence of lysine suggested some mutations that could be done on the  enzyme to gain activity on lysine. Therefore, the suggested mutations were implemented in the MAL  enzyme, aiming at increasing the size of the binding pocket of MAL to give lysine more space to fit in  the active site and make the reaction more feasible. The mutations were successfully introduced in the  MAL gene with a site‐directed mutagenic PCR protocol. The mutated MAL genes were then expressed  in E.coli BL21 (DE3) and the protein purified. The protein purification was done with two methods that  used  the  same  basic  principle:  an  Immobilized  Metal‐ion  Affinity  Chromatography.  After  the  purification, the activity of the mutated enzymes was monitored by various activity assays. The assays  provided the kinetic constants of the conversion of the natural substrate, 3‐methyl aspartate, by the  mutated  enzymes and their plausible activity on  lysine by  detecting the theoretical conversion  products: 6‐aminohex‐2‐enoic acid and ammonia.   No activity on lysine was detected, but still valuable information was retrieved from the activity assays.  Some of the mutated enzymes like L384A, C361A and C361S showed a tremendous impairment in the  activity, which led me to conclude that those residues that were altered are important for the enzyme  catalysis.  

Publikationen registrerades 2017-11-02. Den ändrades senast 2017-11-02

CPL ID: 252912

Detta är en tjänst från Chalmers bibliotek